از بادام سنگی ایرانی به عنوان سنگ در جنگ استفاده شد

تشخیص ژن بادام سنگی ایرانی به منظور شناسایی ژن syrB، از پرایمرهای اختصاصی B1 و B2 برای تکثیر قطعه DNA 752 جفت باز استفاده شد (Sorensen et al. 1998). واکنش PCR در Thermo Cycler 2720 (Applied Biosystems, USA) در حجم کل 25 میکرولیتر انجام شد.

ترکیب اصلی PCR شامل: 18.25 میکرولیتر آب بدون نوکلئاز، 2.5 میکرولیتر از 10 × Dream Taq Green Buffer (شامل 20 میلی مولار MgCl2) (Thermo Scientific، ویلنیوس، لیتوانی)،

0.5 میکرولیتر از 10 میلی‌مولار 1.2 میکرومولار مخلوط dNTP پرایمر، 0.25 میکرولیتر از 5 U/µl Dream Taq DNA پلیمراز (Thermo Scientific، ویلنیوس، لیتوانی)، و 1 میکرولیتر از DNA الگو.

محصولات PCR (5 میکرولیتر) توسط ژل آگارز (1.5٪) الکتروفورز در بافر Tris-acetate-EDTA (TAE) در دمای اتاق و 80 ولت به مدت 45 دقیقه جدا شدند، در اتیدیوم بروماید (1 میکروگرم بر میلی لیتر) رنگ آمیزی شدند و در زیر مشاهده شدند.

نور UV توسط یک دوربین تصویربرداری دیجیتال (Vilber Lourmat، فرانسه). برای کنترل منفی، الگو با همان حجم SDW جایگزین شد.

عصاره DNA از سویه Pss مرجع به عنوان کنترل syrB مثبت در نظر گرفته شد.

توالی 16S rRNA برای چهار جدایه syrB منفی، دو جدا شده از زردآلو (K1 و K2) و دو جدا شده از بادام (B2 و B14) آنالیز شد. آمپلیکون‌هایی برای توالی‌های rRNA 16S با طول حدود 1.024 جفت باز، با استفاده از آغازگرهای جهانی fD1/rP2 (Weisburg و همکاران 1991) تولید شدند.

کروماتوگرام های به دست آمده با توالی یابی (Macrogen Europe, The Netherlands) با استفاده از نرم افزار Finch TV 1.4.0 تجزیه و تحلیل شدند. توالی ها (“به جلو” و “معکوس”) با استفاده از نرم افزار MEGA X (Kumar et al. 2018) پردازش شدند.

برنامه BLAST (Altschul et al. 1997) برای تجزیه و تحلیل مقایسه ای توالی های به دست آمده با توالی های سپرده شده در پایگاه داده NCBI استفاده شد. توالی های جزئی تولید شده با ژن 16S rRNA در بانک اطلاعاتی GenBank سپرده شدند (جدول 1).

آنالیز فیلوژنتیکی MLSA با تکثیر PCR و توالی نسبی 4 ژن سازنده انجام شد: gapA (گلیسرآلدئید-3-فسفات دهیدروژناز A)، gltA (سیترات سنتاز)، gyrB (گیراز B) و rpoD (آزمایش فاکتور RNA پلیمراز sigma70) برای 28 ژن جدا شده بر اساس پروتکل هوانگ و همکاران.